Idées clés
Les méthodes moléculaires transforment l’ADN en nombres : la qPCR donne des variations d’expression, les digestions de restriction des tailles de fragments, les gels des tailles par migration et la PCR des nombres de copies. Chacune a un court calcul.
- qPCR : ΔCt = Ct(cible) − Ct(référence) ; ΔΔCt = ΔCt(traité) − ΔCt(témoin) ; variation en facteur = 2^(−ΔΔCt). Un Ct plus faible signifie plus de matrice de départ.
- Une enzyme de restriction qui coupe un ADN linéaire en k sites donne k + 1 fragments, et un ADN circulaire en donne k. Les tailles des fragments sont les intervalles entre les sites de coupure et les extrémités.
- Sur un gel, log₁₀(taille) est linéaire avec la distance parcourue, donc la taille d’une bande se trouve en interpolant entre marqueurs sur une échelle logarithmique.
- La PCR enchaîne dénaturation (environ 95 °C), hybridation (environ 55 °C) et élongation (environ 72 °C) à chaque cycle, et les copies idéales sont N₀ × 2ⁿ.
Équations clés
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
Exemple résolu
Le gène de référence a Ct 20 dans les deux échantillons. La cible a Ct 26 dans le témoin et 24 dans l’échantillon traité, donc ΔCt = 6 dans le témoin et 4 dans le traité, ΔΔCt = −2 et la variation en facteur est 2² = 4. Une molécule linéaire de 10 kb coupée à 2 kb et 7 kb donne des fragments de 2, 5 et 3 kb, donc le plus grand fait 5 kb. Avec 10 copies de départ et 20 cycles idéaux, on obtient 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ copies.
Erreurs fréquentes
- Utiliser 2^ΔΔCt au lieu de 2^(−ΔΔCt), ce qui inverse la variation en facteur.
- Interpoler un gel linéairement en paires de bases au lieu d’utiliser une échelle logarithmique.
- Compter k fragments pour k coupures d’une molécule linéaire. On en obtient k + 1.
Pratique
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