Kernideen
Molekulare Methoden machen aus DNA Zahlen: Die qPCR liefert Expressionsänderungen, Restriktionsverdaue Fragmentgrößen, Gele Größen über die Wanderung und die PCR Kopienzahlen. Jede hat eine kurze Rechnung.
- qPCR: ΔCt = Ct(Ziel) − Ct(Referenz); ΔΔCt = ΔCt(behandelt) − ΔCt(Kontrolle); Änderungsfaktor = 2^(−ΔΔCt). Ein niedrigerer Ct bedeutet mehr Ausgangsmatrize.
- Ein Restriktionsenzym, das lineare DNA an k Stellen schneidet, ergibt k + 1 Fragmente, bei zirkulärer DNA k. Die Fragmentgrößen sind die Abstände zwischen den Schnittstellen und den Enden.
- Im Gel ist log₁₀(Größe) linear mit der Laufstrecke, die Größe einer Bande findet man also durch Interpolation zwischen Markern auf logarithmischer Skala.
- Die PCR durchläuft in jedem Zyklus Denaturierung (etwa 95 °C), Annealing (etwa 55 °C) und Elongation (etwa 72 °C), und die idealen Kopien sind N₀ × 2ⁿ.
Wichtige Gleichungen
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
Durchgerechnetes Beispiel
Das Referenzgen hat in beiden Proben Ct 20. Das Zielgen hat Ct 26 in der Kontrolle und 24 in der behandelten Probe, also ΔCt = 6 in der Kontrolle und 4 in der behandelten, ΔΔCt = −2 und der Änderungsfaktor 2² = 4. Ein lineares 10-kb-Molekül, bei 2 kb und 7 kb geschnitten, ergibt Fragmente von 2, 5 und 3 kb, das größte ist also 5 kb. Mit 10 Ausgangskopien und 20 idealen Zyklen entstehen 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ Kopien.
Häufige Fehler
- 2^ΔΔCt statt 2^(−ΔΔCt) benutzen, was den Änderungsfaktor invertiert.
- Ein Gel linear in Basenpaaren statt auf logarithmischer Skala interpolieren.
- k Fragmente für k Schnitte eines linearen Moleküls zählen. Es sind k + 1.
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