Ideas clave
Los métodos moleculares convierten el ADN en números: la qPCR da cambios de expresión, las digestiones de restricción dan tamaños de fragmentos, los geles dan tamaños por migración y la PCR da números de copias. Cada uno tiene un cálculo breve.
- qPCR: ΔCt = Ct(diana) − Ct(referencia); ΔΔCt = ΔCt(tratado) − ΔCt(control); cambio en veces = 2^(−ΔΔCt). Un Ct menor significa más molde inicial.
- Una enzima de restricción que corta un ADN lineal en k sitios da k + 1 fragmentos, y uno circular da k. Los tamaños de los fragmentos son los tramos entre los sitios de corte y los extremos.
- En un gel, log₁₀(tamaño) es lineal con la distancia recorrida, así que el tamaño de una banda se halla interpolando entre marcadores en escala logarítmica.
- La PCR realiza desnaturalización (unos 95 °C), hibridación (unos 55 °C) y extensión (unos 72 °C) en cada ciclo, y las copias ideales son N₀ × 2ⁿ.
Ecuaciones clave
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
Ejemplo resuelto
El gen de referencia tiene Ct 20 en ambas muestras. La diana tiene Ct 26 en el control y 24 en la tratada, así que ΔCt = 6 en el control y 4 en la tratada, ΔΔCt = −2 y el cambio en veces es 2² = 4. Una molécula lineal de 10 kb cortada en 2 kb y 7 kb da fragmentos de 2, 5 y 3 kb, así que el mayor es de 5 kb. Con 10 copias iniciales y 20 ciclos ideales se obtienen 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ copias.
Errores comunes
- Usar 2^ΔΔCt en lugar de 2^(−ΔΔCt), lo que invierte el cambio en veces.
- Interpolar un gel linealmente en pares de bases en lugar de en escala logarítmica.
- Contar k fragmentos para k cortes de una molécula lineal. Da k + 1.
Práctica
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