जैव प्रौद्योगिकी और आणविक विधियाँ: अध्ययन गाइड

मुख्य विचार

आण्विक विधियाँ DNA को संख्याओं में बदलती हैं: qPCR अभिव्यक्ति परिवर्तन देती है, प्रतिबंधन पाचन खंडों के आकार देते हैं, जेल अभिगमन से आकार देते हैं और PCR प्रतियों की संख्या देती है। प्रत्येक की एक छोटी गणना है।

• qPCR: ΔCt = Ct(लक्ष्य) − Ct(संदर्भ); ΔΔCt = ΔCt(उपचारित) − ΔCt(नियंत्रण); गुना परिवर्तन = 2^(−ΔΔCt)। कम Ct का अर्थ है आरंभ में अधिक टेम्पलेट।
• रैखिक DNA को k स्थलों पर काटने वाला प्रतिबंधन एंज़ाइम k + 1 खंड देता है, और वृत्ताकार DNA k खंड। खंडों के आकार कटाव स्थलों और सिरों के बीच के अंतराल हैं।
• जेल पर log₁₀(आकार) तय दूरी के साथ रैखिक है, इसलिए बैंड का आकार लघुगणकीय पैमाने पर मार्करों के बीच अंतर्वेशन से मिलता है।
• PCR प्रत्येक चक्र में विकृतीकरण (लगभग 95 °C), एनीलन (लगभग 55 °C) और दीर्घीकरण (लगभग 72 °C) चलाता है, और आदर्श प्रतियाँ N₀ × 2ⁿ हैं।

मुख्य समीकरण

• fold change = 2^(−ΔΔCt)
• copies = N₀ × 2ⁿ
• fragments (linear) = cuts + 1
• log₁₀(size) falls linearly with distance

हल किया हुआ उदाहरण

संदर्भ जीन का Ct दोनों नमूनों में 20 है। लक्ष्य का Ct नियंत्रण में 26 और उपचारित में 24 है, इसलिए नियंत्रण में ΔCt = 6 और उपचारित में 4, ΔΔCt = −2 और गुना परिवर्तन 2² = 4। 2 kb और 7 kb पर कटा 10 kb का रैखिक अणु 2, 5 और 3 kb के खंड देता है, इसलिए सबसे बड़ा 5 kb है। 10 आरंभिक प्रतियों और 20 आदर्श चक्रों से 10 × 2²⁰ ≈ 1.0 × 10⁷ प्रतियाँ मिलती हैं।

आम गलतियाँ

• 2^(−ΔΔCt) की जगह 2^ΔΔCt लगाना, जिससे गुना परिवर्तन उलट जाता है।
• जेल को लघुगणकीय पैमाने के बजाय क्षारक युग्मों में रैखिक रूप से अंतर्वेशित करना।
• रैखिक अणु के k कटावों के लिए k खंड गिनना। वे k + 1 होते हैं।

अभ्यास

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