Главные идеи
Молекулярные методы превращают ДНК в числа: кПЦР даёт изменения экспрессии, рестрикционные гидролизы — размеры фрагментов, гели — размеры по подвижности, а ПЦР — число копий. У каждого есть короткий расчёт.
- кПЦР: ΔCt = Ct(мишени) − Ct(референса); ΔΔCt = ΔCt(опыт) − ΔCt(контроль); кратность изменения = 2^(−ΔΔCt). Меньшее Ct означает больше исходной матрицы.
- Рестриктаза, разрезающая линейную ДНК в k сайтах, даёт k + 1 фрагментов, а кольцевую — k. Размеры фрагментов — это промежутки между сайтами и концами.
- В геле log₁₀(размер) линеен по пройденному расстоянию, поэтому размер полосы находят интерполяцией между маркерами в логарифмическом масштабе.
- ПЦР на каждом цикле проходит денатурацию (около 95 °C), отжиг (около 55 °C) и элонгацию (около 72 °C), а идеальное число копий равно N₀ × 2ⁿ.
Основные формулы
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
Разобранный пример
У референсного гена Ct 20 в обоих образцах. У мишени Ct 26 в контроле и 24 в опыте, значит ΔCt = 6 в контроле и 4 в опыте, ΔΔCt = −2, а кратность изменения 2² = 4. Линейная молекула 10 т.п.н., разрезанная на 2 и 7 т.п.н., даёт фрагменты 2, 5 и 3 т.п.н., наибольший — 5 т.п.н. Из 10 исходных копий за 20 идеальных циклов получается 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ копий.
Частые ошибки
- Использование 2^ΔΔCt вместо 2^(−ΔΔCt), что обращает кратность изменения.
- Линейная интерполяция геля по парам оснований вместо логарифмического масштаба.
- Подсчёт k фрагментов при k разрезах линейной молекулы. Получается k + 1.
Практика
Проверьте себя на тренировочных вопросах по этой теме: Биотехнология и молекулярные методы