Biyoteknoloji ve moleküler yöntemler: çalışma rehberi

Temel fikirler

Moleküler yöntemler DNA’yı sayılara çevirir: qPCR ifade değişimlerini, kısıtlama kesimleri parça boyutlarını, jeller göçle boyutu, PCR de kopya sayılarını verir. Her birinin kısa bir hesabı vardır.

• qPCR: ΔCt = Ct(hedef) − Ct(referans); ΔΔCt = ΔCt(işlem) − ΔCt(kontrol); kat değişimi = 2^(−ΔΔCt). Daha düşük Ct, daha çok başlangıç kalıbı demektir.
• Doğrusal bir DNA’yı k bölgeden kesen bir kısıtlama enzimi k + 1 parça, dairesel bir DNA k parça verir. Parça boyutları kesim bölgeleri ile uçlar arasındaki aralıklardır.
• Jelde log₁₀(boyut) alınan yolla doğrusaldır; bu yüzden bir bandın boyutu logaritmik ölçekte işaretleyiciler arasında enterpolasyonla bulunur.
• PCR her döngüde denatürasyon (yaklaşık 95 °C), bağlanma (yaklaşık 55 °C) ve uzama (yaklaşık 72 °C) yapar; ideal kopya sayısı N₀ × 2ⁿ’dir.

Temel denklemler

• fold change = 2^(−ΔΔCt)
• copies = N₀ × 2ⁿ
• fragments (linear) = cuts + 1
• log₁₀(size) falls linearly with distance

Çözümlü örnek

Referans genin Ct’si iki örnekte de 20’dir. Hedefin Ct’si kontrolde 26, işlem görmüş örnekte 24’tür; yani ΔCt kontrolde 6, işlemde 4, ΔΔCt = −2 ve kat değişimi 2² = 4’tür. 2 kb ve 7 kb’de kesilen 10 kb’lik doğrusal bir molekül 2, 5 ve 3 kb’lik parçalar verir; en büyüğü 5 kb’dir. 10 başlangıç kopyası ve 20 ideal döngüyle 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ kopya elde edilir.

Sık yapılan hatalar

• 2^(−ΔΔCt) yerine 2^ΔΔCt kullanmak; bu kat değişimini tersine çevirir.
• Jeli logaritmik ölçek yerine baz çiftleri cinsinden doğrusal olarak enterpole etmek.
• Doğrusal bir molekülün k kesimi için k parça saymak. k + 1 parça olur.

Alıştırma

Bu konudaki alıştırma sorularıyla kendinizi sınayın: Biyoteknoloji ve moleküler yöntemler