重要なポイント
分子生物学の方法は DNA を数値に変える。qPCR は発現変化を、制限酵素消化は断片の大きさを、ゲルは泳動距離から大きさを、PCR はコピー数を与える。それぞれに短い計算がある。
- qPCR: ΔCt = Ct(標的) − Ct(参照)、ΔΔCt = ΔCt(処理) − ΔCt(対照)、倍率変化 = 2^(−ΔΔCt) である。Ct が小さいほど出発鋳型が多い。
- 直鎖状 DNA を k か所で切る制限酵素は k + 1 個の断片を、環状 DNA は k 個の断片を与える。断片の大きさは、切断部位と末端の間の長さである。
- ゲルでは log₁₀(サイズ) が泳動距離に対して直線的なので、バンドの大きさはマーカーの間を対数目盛で内挿して求める。
- PCR は 1 サイクルごとに変性(約 95 °C)、アニーリング(約 55 °C)、伸長(約 72 °C)を行い、理想的なコピー数は N₀ × 2ⁿ である。
主な式
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
例題
参照遺伝子の Ct は両方の試料で 20 である。標的の Ct は対照で 26、処理試料で 24 なので、ΔCt は対照で 6、処理で 4、ΔΔCt = −2 で、倍率変化は 2² = 4 である。10 kb の直鎖状分子を 2 kb と 7 kb の位置で切ると 2、5、3 kb の断片になり、最大は 5 kb である。最初のコピー数 10、理想的な 20 サイクルでは 10 × 2²⁰ ≈ 1.0 × 10⁷ コピーになる。
よくある間違い
- 2^(−ΔΔCt) ではなく 2^ΔΔCt を使い、倍率変化を逆にすること。
- ゲルを対数目盛ではなく、塩基対で直線的に内挿すること。
- 直鎖状分子の k か所の切断で k 個の断片と数えること。k + 1 個である。
練習
このトピックの練習問題で力試しをしましょう:バイオテクノロジーと分子生物学的手法