Ideias principais
Os métodos moleculares transformam o DNA em números: a qPCR dá mudanças de expressão, as digestões de restrição dão tamanhos de fragmentos, os géis dão tamanhos por migração e a PCR dá números de cópias. Cada um tem um cálculo curto.
- qPCR: ΔCt = Ct(alvo) − Ct(referência); ΔΔCt = ΔCt(tratado) − ΔCt(controle); variação em vezes = 2^(−ΔΔCt). Um Ct menor significa mais molde inicial.
- Uma enzima de restrição que corta um DNA linear em k sítios dá k + 1 fragmentos, e um circular dá k. Os tamanhos dos fragmentos são os trechos entre os sítios de corte e as extremidades.
- Em um gel, log₁₀(tamanho) é linear com a distância percorrida, então o tamanho de uma banda se acha interpolando entre marcadores em escala logarítmica.
- A PCR faz desnaturação (cerca de 95 °C), anelamento (cerca de 55 °C) e extensão (cerca de 72 °C) em cada ciclo, e as cópias ideais são N₀ × 2ⁿ.
Equações principais
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
Exemplo resolvido
O gene de referência tem Ct 20 nas duas amostras. O alvo tem Ct 26 no controle e 24 na tratada, então ΔCt = 6 no controle e 4 na tratada, ΔΔCt = −2 e a variação em vezes é 2² = 4. Uma molécula linear de 10 kb cortada em 2 kb e 7 kb dá fragmentos de 2, 5 e 3 kb, então o maior é 5 kb. Com 10 cópias iniciais e 20 ciclos ideais obtêm-se 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ cópias.
Erros comuns
- Usar 2^ΔΔCt em vez de 2^(−ΔΔCt), o que inverte a variação em vezes.
- Interpolar um gel linearmente em pares de bases em vez de em escala logarítmica.
- Contar k fragmentos para k cortes de uma molécula linear. Dá k + 1.
Prática
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