Gagasan utama
Metode molekuler mengubah DNA menjadi angka: qPCR memberi perubahan ekspresi, digesti restriksi memberi ukuran fragmen, gel memberi ukuran melalui migrasi, dan PCR memberi jumlah salinan. Masing-masing memiliki perhitungan singkat.
- qPCR: ΔCt = Ct(target) − Ct(referensi); ΔΔCt = ΔCt(perlakuan) − ΔCt(kontrol); perubahan lipat = 2^(−ΔΔCt). Ct lebih rendah berarti cetakan awal lebih banyak.
- Enzim restriksi yang memotong DNA linear pada k situs menghasilkan k + 1 fragmen, dan DNA sirkular menghasilkan k. Ukuran fragmen adalah jarak antara situs potong dan ujung.
- Pada gel, log₁₀(ukuran) linear terhadap jarak tempuh, sehingga ukuran pita ditemukan dengan interpolasi di antara penanda pada skala log.
- PCR menjalankan denaturasi (sekitar 95 °C), penempelan (sekitar 55 °C), dan pemanjangan (sekitar 72 °C) pada tiap siklus, dan salinan ideal adalah N₀ × 2ⁿ.
Persamaan penting
fold change = 2^(−ΔΔCt)copies = N₀ × 2ⁿfragments (linear) = cuts + 1log₁₀(size) falls linearly with distance
Contoh soal
Gen referensi memiliki Ct 20 pada kedua sampel. Target memiliki Ct 26 pada kontrol dan 24 pada sampel perlakuan, sehingga ΔCt = 6 pada kontrol dan 4 pada perlakuan, ΔΔCt = −2 dan perubahan lipat 2² = 4. Molekul linear 10 kb yang dipotong pada 2 kb dan 7 kb menghasilkan fragmen 2, 5, dan 3 kb, sehingga yang terbesar 5 kb. Dengan 10 salinan awal dan 20 siklus ideal diperoleh 10 × 2²⁰ ≈ 1,0 × 10⁷ salinan.
Kesalahan umum
- Memakai 2^ΔΔCt, bukan 2^(−ΔΔCt), yang membalik perubahan lipat.
- Menginterpolasi gel secara linear dalam pasangan basa, bukan pada skala log.
- Menghitung k fragmen untuk k pemotongan molekul linear. Hasilnya k + 1.
Latihan
Uji dirimu dengan soal latihan tentang topik ini: Bioteknologi dan metode molekuler