Calcul du coefficient d'extinction d'une protéine

Comment calculer le coefficient d'extinction d'une protéine

1. Collez la séquence de la protéine en code à une lettre. Pour une protéine à plusieurs chaînes, comme un anticorps, collez chaque chaîne comme un enregistrement FASTA, une fois par copie : deux chaînes lourdes et deux légères pour une IgG.
2. Indiquez si les cystéines forment des ponts disulfure, comme dans la plupart des protéines sécrétées et purifiées repliées, ou si elles sont réduites, comme dans un échantillon avec du DTT ou dans le cytoplasme.
3. Le coefficient d'extinction molaire à 280 nm s'affiche en M⁻¹ cm⁻¹, avec l'Abs 0,1 % et la masse moléculaire.

Questions fréquentes

Comment le coefficient d'extinction est-il calculé ?

Par la méthode de Pace et al. (1995) : ε280 = 5 500 × nombre de tryptophanes + 1 490 × nombre de tyrosines + 125 × nombre de cystines, en M⁻¹ cm⁻¹. Une cystine est une paire de cystéines reliées par un pont disulfure. ExPASy ProtParam utilise les mêmes valeurs, les résultats concordent donc.

Qu'est-ce que l'Abs 0,1 % ?

L'absorbance à 280 nm d'une solution à 1 mg/mL (0,1 %) dans une cuve de 1 cm : le coefficient d'extinction molaire divisé par la masse moléculaire. Divisez une mesure d'A280 par cette valeur pour obtenir la concentration en mg/mL. On l'écrit aussi E0,1 % ou, pour une solution à 1 %, E1 % = 10 × Abs 0,1 %.

Quel est le coefficient d'extinction d'un anticorps ?

Pour une IgG humaine ou de souris typique, l'Abs 0,1 % est d'environ 1,4 (E1 % d'environ 14), soit pour 150 kDa un coefficient molaire d'environ 210 000 M⁻¹ cm⁻¹. La valeur exacte dépend des régions variables : collez les chaînes lourde et légère pour obtenir celle de votre anticorps.

Quelle est la précision d'un coefficient calculé à partir de la séquence ?

Pour la plupart des protéines, il est à moins d'environ 5 % de la valeur mesurée, tant que la protéine contient des tryptophanes. Sans tryptophane, la valeur est moins sûre, et sans tryptophane ni tyrosine la protéine absorbe à peine à 280 nm. Les cofacteurs liés, comme l'hème ou les flavines, absorbent aussi et ne sont pas comptés.