Kalkulator Koefisien Ekstingsi Protein

Cara menghitung koefisien ekstingsi protein

1. Tempel sekuens protein dalam kode satu huruf. Untuk protein dengan beberapa rantai, seperti antibodi, tempel tiap rantai sebagai rekaman FASTA sendiri, sekali untuk tiap salinan: dua rantai berat dan dua rantai ringan untuk IgG.
2. Pilih apakah sistein membentuk ikatan disulfida, seperti pada kebanyakan protein sekretori dan protein terlipat yang dimurnikan, atau tereduksi, seperti pada sampel dengan DTT atau di sitoplasma.
3. Koefisien ekstingsi molar pada 280 nm muncul dalam M⁻¹ cm⁻¹, beserta Abs 0,1% dan berat molekul.

Pertanyaan umum

Bagaimana koefisien ekstingsi dihitung?

Dengan metode Pace dkk. (1995): ε280 = 5.500 × jumlah triptofan + 1.490 × jumlah tirosin + 125 × jumlah sistin, dalam M⁻¹ cm⁻¹. Sistin adalah sepasang sistein yang dihubungkan ikatan disulfida. ExPASy ProtParam memakai nilai yang sama, jadi hasilnya cocok.

Apa itu Abs 0,1%?

Absorbansi pada 280 nm larutan 1 mg/mL (0,1%) dalam kuvet 1 cm: koefisien ekstingsi molar dibagi berat molekul. Bagi bacaan A280 dengan nilai ini untuk mendapat konsentrasi dalam mg/mL. Ditulis juga E0,1% atau, untuk larutan 1%, E1% = 10 × Abs 0,1%.

Berapa koefisien ekstingsi antibodi?

Untuk IgG manusia atau tikus yang umum, Abs 0,1% sekitar 1,4 (E1% sekitar 14), yang untuk 150 kDa setara koefisien molar sekitar 210.000 M⁻¹ cm⁻¹. Nilai sebenarnya bergantung pada daerah variabel, jadi tempel rantai berat dan ringan untuk mendapat nilai antibodi Anda.

Seberapa akurat koefisien dari sekuens?

Untuk kebanyakan protein, selisihnya kurang dari sekitar 5% dari nilai terukur, asalkan protein punya triptofan. Tanpa triptofan nilainya kurang pasti, dan tanpa triptofan maupun tirosin protein hampir tidak menyerap pada 280 nm. Kofaktor terikat seperti heme atau flavin juga menyerap dan tidak dihitung.