Calculadora do coeficiente de extinção de proteínas

Como calcular o coeficiente de extinção de uma proteína

1. Cole a sequência da proteína em código de uma letra. Para uma proteína de várias cadeias, como um anticorpo, cole cada cadeia como um registro FASTA, uma vez para cada cópia: duas cadeias pesadas e duas leves para uma IgG.
2. Escolha se as cisteínas formam pontes dissulfeto, como na maioria das proteínas secretadas e purificadas enoveladas, ou estão reduzidas, como numa amostra com DTT ou no citoplasma.
3. O coeficiente de extinção molar a 280 nm aparece em M⁻¹ cm⁻¹, com a Abs 0,1% e o peso molecular.

Perguntas frequentes

Como o coeficiente de extinção é calculado?

Pelo método de Pace et al. (1995): ε280 = 5.500 × o número de triptofanos + 1.490 × o número de tirosinas + 125 × o número de cistinas, em M⁻¹ cm⁻¹. Uma cistina é um par de cisteínas ligadas por uma ponte dissulfeto. O ExPASy ProtParam usa os mesmos valores, então os resultados coincidem.

O que é Abs 0,1%?

A absorbância a 280 nm de uma solução de 1 mg/mL (0,1%) numa cubeta de 1 cm: o coeficiente de extinção molar dividido pelo peso molecular. Divida uma leitura de A280 por ela para obter a concentração em mg/mL. Também se escreve E0,1% ou, para uma solução a 1%, E1% = 10 × Abs 0,1%.

Qual é o coeficiente de extinção de um anticorpo?

Para uma IgG humana ou de camundongo típica, a Abs 0,1% é de cerca de 1,4 (E1% de cerca de 14), o que para 150 kDa dá um coeficiente molar de cerca de 210.000 M⁻¹ cm⁻¹. O valor real depende das regiões variáveis, então cole as cadeias pesada e leve para ter o do seu anticorpo.

Qual a precisão de um coeficiente calculado pela sequência?

Para a maioria das proteínas fica a menos de 5% do valor medido, desde que a proteína tenha triptofanos. Sem triptofano o valor é menos seguro, e sem triptofano nem tirosina a proteína quase não absorve a 280 nm. Cofatores ligados, como heme ou flavinas, também absorvem e não são contados.