Extinktionskoeffizient von Proteinen berechnen
So berechnest du den Extinktionskoeffizienten eines Proteins
- Füge die Proteinsequenz im Einbuchstabencode ein. Bei einem Protein aus mehreren Ketten, etwa einem Antikörper, füge jede Kette als eigenen FASTA-Eintrag ein, einmal pro Kopie: zwei schwere und zwei leichte Ketten für ein IgG.
- Wähle, ob die Cysteine Disulfidbrücken bilden, wie bei den meisten sezernierten und gereinigten gefalteten Proteinen, oder reduziert sind, wie in einer Probe mit DTT oder im Cytoplasma.
- Der molare Extinktionskoeffizient bei 280 nm erscheint in M⁻¹ cm⁻¹, mit Abs 0,1 % und Molekulargewicht.
Häufige Fragen
Wie wird der Extinktionskoeffizient berechnet?
Nach der Methode von Pace et al. (1995): ε280 = 5.500 × Anzahl der Tryptophane + 1.490 × Anzahl der Tyrosine + 125 × Anzahl der Cystine, in M⁻¹ cm⁻¹. Ein Cystin ist ein Paar Cysteine, verbunden durch eine Disulfidbrücke. ExPASy ProtParam verwendet dieselben Werte, die Ergebnisse stimmen also überein.
Was ist Abs 0,1 %?
Die Absorption bei 280 nm einer Lösung von 1 mg/mL (0,1 %) in einer 1-cm-Küvette: der molare Extinktionskoeffizient geteilt durch das Molekulargewicht. Teile einen A280-Messwert dadurch, um die Konzentration in mg/mL zu erhalten. Man schreibt auch E0,1 % oder, für eine 1-%-Lösung, E1 % = 10 × Abs 0,1 %.
Wie hoch ist der Extinktionskoeffizient eines Antikörpers?
Für ein typisches menschliches oder Maus-IgG liegt Abs 0,1 % bei etwa 1,4 (E1 % etwa 14), was bei 150 kDa einem molaren Koeffizienten von rund 210.000 M⁻¹ cm⁻¹ entspricht. Der genaue Wert hängt von den variablen Regionen ab, also füge die schwere und leichte Kette ein, um den Wert deines Antikörpers zu bekommen.
Wie genau ist ein Koeffizient aus der Sequenz?
Bei den meisten Proteinen liegt er weniger als etwa 5 % vom gemessenen Wert entfernt, sofern das Protein Tryptophane hat. Ohne Tryptophan ist er unsicherer, und ohne Tryptophan und Tyrosin absorbiert das Protein bei 280 nm kaum. Gebundene Kofaktoren wie Häm oder Flavine absorbieren ebenfalls und werden nicht mitgezählt.