प्रोटीन एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट कैलकुलेटर
प्रोटीन का एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट कैसे निकालें
- प्रोटीन सीक्वेंस एक-अक्षर कोड में पेस्ट करें। कई चेन वाले प्रोटीन, जैसे एंटीबॉडी, के लिए हर चेन को अलग FASTA रिकॉर्ड के रूप में, हर कॉपी के लिए एक बार पेस्ट करें: IgG के लिए दो हेवी और दो लाइट चेन।
- चुनें कि सिस्टीन डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड बनाते हैं, जैसा ज़्यादातर स्रावित और शुद्ध किए गए फ़ोल्डेड प्रोटीन में होता है, या रिड्यूस्ड हैं, जैसा DTT वाले सैंपल या साइटोप्लाज़्म में होता है।
- 280 nm पर मोलर एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट M⁻¹ cm⁻¹ में दिखता है, साथ में Abs 0.1% और आणविक भार।
अक्सर पूछे जाने वाले सवाल
एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट कैसे निकाला जाता है?
Pace et al. (1995) की विधि से: ε280 = 5,500 × ट्रिप्टोफ़ैन की संख्या + 1,490 × टायरोसिन की संख्या + 125 × सिस्टीन जोड़ों (सिस्टाइन) की संख्या, M⁻¹ cm⁻¹ में। सिस्टाइन दो सिस्टीन का डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड से जुड़ा जोड़ा है। ExPASy ProtParam भी यही मान इस्तेमाल करता है, इसलिए नतीजे मिलते हैं।
Abs 0.1% क्या है?
1 cm क्यूवेट में 1 mg/mL (0.1%) घोल का 280 nm पर अवशोषण: मोलर एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट को आणविक भार से भाग देने पर। mg/mL में सांद्रता के लिए A280 रीडिंग को इससे भाग दें। इसे E0.1% भी लिखते हैं, और 1% घोल के लिए E1% = 10 × Abs 0.1%।
एंटीबॉडी का एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट कितना होता है?
एक आम मानव या चूहे के IgG के लिए Abs 0.1% लगभग 1.4 (E1% लगभग 14) होता है, जो 150 kDa के लिए लगभग 210,000 M⁻¹ cm⁻¹ का मोलर कोएफ़िशिएंट है। असली मान वेरिएबल क्षेत्रों पर निर्भर करता है, इसलिए अपनी एंटीबॉडी का मान पाने के लिए हेवी और लाइट चेन पेस्ट करें।
सीक्वेंस से निकाला गया कोएफ़िशिएंट कितना सटीक है?
ज़्यादातर प्रोटीन के लिए यह मापे गए मान से लगभग 5% के भीतर रहता है, बशर्ते प्रोटीन में ट्रिप्टोफ़ैन हो। ट्रिप्टोफ़ैन न हो तो मान कम पक्का है, और ट्रिप्टोफ़ैन व टायरोसिन दोनों न हों तो प्रोटीन 280 nm पर लगभग कुछ नहीं सोखता। हीम या फ़्लेविन जैसे बंधे कोफ़ैक्टर भी सोखते हैं और गिने नहीं जाते।